动物细胞培养
前 言
v 1885年Roux最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语。
v 1907年Harrison 和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养。
v 由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系（Gey，1952），可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展。
组织培养中热门的研究领域
1)细胞内部的活动，如DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢；
2)细胞内部的流动，如RNA从细胞核向细胞质方向运转，激素受体复合物的易位等；
3)生态学，如营养、感染、病毒或化学诱变、药物作用；
4)细胞与细胞之间的相互作用，如胚胎诱导、细胞群体的动力学等。
组织培养的分类及基本概念
分类:
1.组织培养(Tissue Culture) 指的是从体内取出组织，在模拟体内生理环境，无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
2.细胞培养(Cell Culture) 培养物是单个细胞和细胞群。
3.器官培养（Organ Culture） 培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。
组织培养的细胞生物学特点
体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖（Atavism）现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱或不显、细胞趋单一化、不死性、恶性状。
2.细胞增殖和分化：是细胞生命进化中所获得的基本属性，增殖使细胞数量增多；分化使机体结构和功能多样化，最后演变成完整的有机体。
培养细胞的分化
细胞分化机制是极其复杂的，是在细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程。
v 不适应（Deadaption）
细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显。例如肝细胞在体外丧失了产生酪氨酸转移酶的特性。
v 脱分化（去分化）（Dedifferentiation）
由于基因变异而使细胞失去分化能力。如肝细胞失掉产生精氨酸酶及氨基酸转移酶的特性后，储存肝糖元的能力丧失，并很难再现。
v 不适应和脱分化两个概念不同：不适应是因为生存条件改变而使分化发生抑制；从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致。
培养细胞的形态
1.贴附型：
1）成纤维细胞：心肌细胞，血管内皮细胞等
2）上皮型细胞：消化管外皮细胞，肝脏上皮细胞等
3）游走型细胞：神经胶质细胞
4）多形型细胞：神经组织细胞
2.悬浮型：如癌细胞
培养细胞的生长和增殖
.原代培养（Primary Culture）阶段：或称初代培养。从体内取出组织接种培养到第一次传代，随不同的组织时间长短不一，一般为1~4w
2.传代培养（Subculture）阶段：或称继代培养。也就是细胞系（Cell line）阶段，细胞增殖旺盛，一般细胞可传代10-50代）。
.衰退阶段：
自发性转化（Spontaneous Transformation）：其标志是获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）: 细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系(Infinite cell line)或连续细胞系(Continuous cell line)。
如：BHK（仓鼠肾成纤维细胞），F9（小鼠胚胎癌细胞），M2R（黑色素瘤细胞）等。
培养细胞的传代培养
v 当细胞生长达到一定密度后，都需要做传代处理，传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞的数量和细胞增殖速度有关。
v 所谓细胞“一代”，即从细胞接种到分离再培养的一段时间。如某一细胞系为50代即该细胞已传代50次。
细胞传代的三个阶段
）潜伏期（Latent phase）：
细胞从接种到贴壁生长繁殖的一段时间。
二倍体细胞该期时间长（24~96h）；
连续细胞系时间短（10~30min）
2) 指数生长期（Logarthmic growth phase）：
细胞增殖最旺盛时期，一般用细胞分裂指数（Mitotic index，MI）表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数介于0.1~0.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、温度等影响。
v 指数生长期是细胞活力最好的时期，在接种细胞数量适宜情况下，指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制（Contact inhibition）。而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。
v 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑制（Density inhibition
3)停滞期（Stagnate phase）：
即细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累，PH下降细胞停止增殖，进入停滞期。在此时应及时进行换液传代，否则因细胞中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再传1-2代后，细胞才能恢复。
细胞培养的基本条件
1)仪器和设备:
常规的细胞培养设备：如CO2孵箱；
培养器材：如培养瓶，纯水设备，干燥消毒除菌设备，清洗设备等。
2)培养液:目前常用的基础培养液均已商品化，如RPMI1640，MEM，DMEM，F12等，可根据培养需求合理选择。
3)血清：一般常用为小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它动物血清。
由于不同的研究目的，血清成分往往干扰研究实验，如进行药物和受体及营养等方面的研究时，需要使用无血清培养基。
4)平衡盐溶液:主要用于作为稀释和灌注的液体，维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸监度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。
常用的有PBS，Hank’s等。
5)抗生素:常用为青霉素（每毫升培养液50~100单位）和链霉素（每毫升培养液50~100微克）。
6)其它添加成分：
缓冲系统，常用为HEPES（N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid），缓冲效能(pKa)在20℃时为7.55，37℃为7.31； HEPES不是起维持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH变化的，所以调整pH常常用NaHCO3溶液。
有机补充物，如丙酮酸钠， 谷胺酰氨等。
促细胞分裂因子，如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。
贴壁和铺展因子，如胶原蛋白，纤粘蛋白等。
可根据培养细胞的特殊要求进行添加。
培养液的物理性质
v pH值：大多数细胞在pH7.4时生长最好，一般不低于6.8，不高于7.6。酚红是常用的指示剂，用来检测PH的变化：红色--pH7.4，橙色--pH7.0，黄色--pH6.5，蓝红色--pH7.6，紫色--pH7.8。
v 温度：温度除直接影响细胞生长外，还与培养液的pH值有关，温度低时CO2溶解性增加，从而影响pH。
v 渗透压：培养液渗透压一般介于260~320 mosm/kg之间。
人类血浆渗透压290mosm /kg，小鼠类为310mosm /kg。
v 粘度：由于血清的存在，直接影响培养液粘度。
v 表面张力：培养液的表面张力有利于培养物粘着于底物上面。
细胞培养的基本方法
.组织、细胞的解离方法
1.1 解离组织：在无菌情况下采取动物的组织或器官，放在含有抗生素的平衡盐溶液(BSS)中，然后尽快在超净台或无菌室内进行解离处理。
解离时应注意:
1) 尽可能将脂肪和坏死组织去除干净；
2) 剪碎组织时，避免损伤组织块；
3) 解离组织用的各种酶系，需要先进行低速离心。
解离细胞
常用酶和鳌合剂进行解离：
当实验室需要制备具有均匀细胞层的培养物；
从单个细胞出发获得细胞群体；
从一定量的组织中获得最多的细胞量时。
解离细胞的方法
）胰蛋白酶解离细胞法：所需时间较短，主要缺点是破损细胞。
2）胶原酶解离细胞法：这种方法对解离胚胎性、正常和恶性组织是很有效的。胶原酶最终浓度200u/ml，36.5℃温育，一般温育4-48h。胶原酶和透明质酸酶协同作用有助于分离大鼠或兔的肝脏组织。
3）机械解离细胞法：比酶法所需时间短，但细胞存活率较低。
4）螯合剂解离细胞法：分离效果差
原代细胞培养
1）外植块培养：外植块在一定限度内可保持其原有组织结构，有利于其适应体外培养环境。短期培养的外植块成为细胞培养的材料来源之一。
2）单层细胞培养：每隔1~3d换液一次，细胞长成单层后传代培养。
3）悬浮细胞培养：使细胞成悬浮状态在培养液中连续生长。
v 由于细胞本身是不粘附的，如小鼠白血病细胞和腹水肿瘤细胞；
v 通过机械搅动使细胞保持悬浮状态；
v 通过选择培养得到能悬浮生长的细胞进行悬浮培养。
细胞培养中应注意的几个问题
1）培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度。
2）PH：初培养pH应为7.4，培养过程应不低于7.0。
3）培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10
4）容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面积的比例为0.2~0.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的培养液（5mm）中生长较好。
5）去除死细胞
6）温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5℃，细胞生长缓慢；温度高于37.5℃，细胞存活力降低。
细胞系及其鉴定
原代培养的培养物中所含的细胞类型多而复杂。因此在培养初期，存活和生长的细胞类型也是多种多样的。所以再培养不仅仅是为了维持细胞不断地生长，而且是使培养物逐步成为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，即细胞系(Cell line)。
细胞克隆技术
v 培育细胞系可采用细胞克隆技术。
v 一个克隆的细胞群体是从一个单一母细胞繁殖而来，分离单一细胞并使其繁殖为一细胞群体的方法称为克隆化(cloning)。
细胞克隆技术的方法
1.稀释铺板法
2.饲养层克隆法
3.胶原膜板或纤维蛋白膜板克隆法
4.琼脂克隆法
5.在琼脂基底上用甲基纤维素克隆法
细胞系鉴定
当细胞系建立后，应对细胞系进行一系列鉴定后，才能应用于细胞生物学、免疫学、细胞遗传学等方面的研究。鉴定内容应包括:
1)细胞系的细胞来源；
2)鉴定细胞系的纯度，即除了主类细胞外，还杂有哪类细胞；
3)细胞系的稳定性，即在细胞连续培养过程中主要指标应无明显变化；
4)累积细胞系的形态及其表达特征的基本数据，以及其与来源细胞的差异等；
细胞系鉴定指标
1.形态学：活细胞观察；固定染色观察培养细胞。
2.染色体：
染色体是一种鉴定细胞系的种属、性别来源较为确切的指标；也是检查细胞系是否趋于稳定，在离体培养条件下细胞有否发生转化的可靠指标；是区别正常细胞与恶性细胞的指标。
采用染色体数目、核型分析以及染色体分带技术检测。
3.同工酶谱：
通常采用G6PD(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、LDH(乳酸脱氢酶)、核苷磷酸化酶三种方法，根据条件选择。
4.细胞DNA遗传特征:
限制性片断长度多态性(restriction fragment length polymorphism RFLP) 是指那些在生物进化过程中，DNA序列发生某些中性突变，突变的结果是失去或获得一个酶切点，因此当基因组DNA用限制性内切酶酶切后，限制性内切酶片断加长或缩短；用同源的克隆DNA为探针可以探测出来。另外也可能在生物进化过程中DNA分子结构发生重排，使DNA碱基排列序列改变，影响内切酶切点,使内切酶酶切片断呈多态性。
一般采用Southern印迹杂交法检测
培养细胞的污染问题及检测
细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念。遇到培养污染要分析原因，及时处理。
细胞污染的种类和判定
细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原体和病毒等。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染：
1) 培养液的酸碱度发生异常的改变。
2)培养液出现混浊。
3)光镜观察到菌丝和颗粒。
4)细胞出现死亡或增殖缓慢等。
污染物的检测
1.细菌和真菌污染的检测：
1）涂片染色镜检；
2）接种培养：Trypticase大豆肉汤、BHI、Thioglycocollate肉汤和血琼脂板适于广泛的细菌检测；Sabouraud肉汤、YM肉汤和营养肉汤适于检测真菌。
检测到阳性结果后，应高压灭菌处理污染的培养物及其用具。
2.支原体检测:
支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰病毒的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略
支原体检测方法和处理
1）荧光技术检测：支原体含有DNA，能与一种荧光染料Hoechest 33258特异性的结合，可根据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支原体。
2）直接培养法：实验室常用。
3）放射自显影检测：
4）DNA分子杂交：
检测完毕后，所有实验用具均应经过高压消毒处理。
5）污染支原体后的处理：
v 抗生素处理：如加入泰乐菌素等。
v 共培养法：与巨噬细胞共培养。
v 重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，4~5周后，重复克隆2次。
v 过滤法：0.22µm孔径滤膜正压过滤。
污染病毒的检测
1）致细胞病变效应（CPE）或集落的检测：采用相差显微镜检测
2）血细胞吸附试验；
3）鸡胚接种。
细胞间交叉污染
为避免细胞间交叉污染，应注意：
- 了解各细胞系的特征；
- 培养各细胞系的操作手续要快速；
- 培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等；
- 吸过培养液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培养液和酶的瓶内；
- 经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改变，通过染色体或同工酶谱分析，检查是否有交叉污染。
细胞保存
在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）。要获得好的冻存与复苏效果，必须了解如下几个问题：冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。
1、 冷冻速率
冷冻速率是指降温的速度，是活细胞能否被冷冻到一个能永久保存的温度的一个主要因素。冷冻速率太快或太慢都会造成细胞的损伤，只有以最适的冷冻速率冷冻细胞，才能获得最佳的冷冻保存效果。
不同细胞最适冷冻速率的值也有所不同，如小鼠骨髓干细胞、酵母、人红细胞最适冷冻速度分别是1.6℃、7℃和200/分。所以一种细胞冷冻保存之前要测试出其最适冷冻速度，拟保证获得最高冷冻存活率。
2、复温速率
复温速率是指细胞复苏时温度升高的速度。冷冻保存的细胞复苏时，复温速率不当也会降低冷冻存活率。一般来说复温速度越快越好，37℃水浴中，1～2分钟内要完成复温。
3、冷冻保护剂
冷冻保护剂是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，常被加到一定的溶液中进行配制，作为冷冻保护液。红细胞、大多数微生物和极少数有核的哺乳类动物细胞悬浮在水或简单的盐溶液中而不加冷冻保护剂，以最适的冷冻速率冷冻保存可获得活的冻存物。
v 对大多数有核哺乳类动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冻存物。
v 目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。
v 具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等，。
v 非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉等。
4、冷冻保存温度
冷冻保存温度是指能长久保存细胞的一个深低温度。在这样的温度下，细胞生化反应极其缓慢或停止，但经长期保存和复苏后仍能保持正常的结构和功能。从实际和效益的观点出发，液氮温度（﹣196℃）是目前最佳冷冻保存温度。
